精子线粒体膜电位资料与方法

一、研究对象 选择2023年4一7月于江苏省中医院男科门 诊就诊并进行孕前优生健康检查、生育咨询的已 婚男性以及初诊的男性不育症患者作为研究 对象。 精液质量正常组纳入标准：年龄18～50岁；生殖 器及附属性腺发育正常，,性生活正常；精液量>2ml、 pH值7.2～7.8、精子浓度≥15×10°/ml、PR≥ 32%、精子形态正常率≥4%、精子DNA碎片指数 (DFI)<30%。精液质量异常组纳人标准:病程>1 年； PR<32%、精子形态正常率<4%、精子DFI≥ 30%；就诊前未进行过生育方面治疗和用药。 排除标准：男性免疫性不育；内分泌功能异常； 生殖器官先天畸形或精子排出障碍所引起的不育； 生殖系统感染或因高温、辐射、油漆等明确因素所引 起的死精子症；近3个月内服用抗癫痫、抗肿瘤等影 响精子生成与存活的药物；合并严重心脑血管疾病、 血液系统疾病；肝、肾功能不全者。 共纳人124例患者。根据不同精液质量分为两 组：精液质量各项指标均正常，即精液量>2ml、pH 值7.2～7.8、精子浓度≥15X10°/ml、PR≥32%、精 子形态正常率≥4%、DFI<30%为精液质量正常组(n=57）。PR<32%、精子形态正常率<4%、DFI 30%为精液质量异常组（n=67)。 所有样本均在征得患者知情同意下进行采集， 其使用和处理均按南京中医药大学附属医院伦理委 员会相关管理和监督条例及标准进行，取得伦理委 员会审查（2023NL-094-02)同意。

二、主要试剂和仪器 流式细胞仪（ACEA/D2040R，北京安捷伦），计 算机辅助精液分析系统（S3-3全自动精子质量分析 仪，上海北昂），低速离心机（BY-G16型，河北白洋 离心机厂），精子线粒体膜染色试剂盒（FC0711AR， 成都赛雷纳)和精子核完整性染色试剂盒（FC9711A， 成都赛雷纳）。 三、研究方法 1．精液常规检测：精液标本均在禁欲3～7d手 淫法留取，精液样本置于37℃水浴箱孵育，30min 后记录液化程度和时间、精液颜色，测量精液体积、 pH值。取10μl液化完全的精液样本至精子计数 板，盖盖玻片后静置1min，于光学显微镜下200倍 视野下选择精子分布均匀的10个小方格分析PR 并计算百分率。取10个小方格的总精子个数(N) 除以每个样本所计数总排数（n）的体积乘以稀释倍 数为精子浓度（C),C=（N/n）X（1/20）X稀释倍 数，重复计算后取平均值。 2.精子形态学涂片及染色：用加样器吸取2～ 10ml精液标本滴至载玻片一端5mm处，采用拉薄 技术进行涂片，静置后经空气干燥再浸人95%乙醇 中固定15min以上；计数200个精子，分别记录正 常形态精子数目、头部缺陷、颈部缺陷和尾部缺陷精 子数目，并统计精子缺陷总数，根据记录结果计算精 子形态正常率，重复计数200个精子后取平均值，检 测结果经审核后签发报告。 3．精子DFI检测：按试剂盒说明书，将液化的 精液用37℃缓冲液稀释精子至1～2×10°/ml;将 500μl稀释过的精子加入到流式细胞仪上样管中， 加入酸化处理缓冲液30s后加入试剂盒中的染色 液;在酸化处理后利用吖啶橙染料与双链DNA结 合发绿色或黄色荧光，与单链DNA结合发红色荧 光的特性，确定精子DNA碎片化程度；设定流式细 胞仪的校准，将检测管上机，每管样本至少连续测定 两次，每管样本至少记录样本主群5000个细胞并 使用DFIView软件统计分析；染色后的精子细胞悬 液通过流式细胞仪收集精子的红绿荧光信号（即FITC与PerCP荧光信号），通过收集到的红色荧光 精子占收集精子总数的比例，判定样本的DFI。 4.精子MMP检测：按照精子线粒体膜染色试 剂盒说明书，用0.01mol/L、pH7.4的PBS洗涤精 液标本两次后，300g离心5min，弃上清液后PBS 重悬沉淀精子，将样本浓度调至1～2×106个/ml, 试剂盒预先置于室温15min，调节恒温水浴箱至 37℃，85℃预热金属浴，每个样本准备并标记对照管 和检测管。每管加100μl试剂盒中的A液后，加人 精子样本取样量（μl)=1×10°/浓度，将对照管置于 金属浴85℃温育2min后取出置于室温静置灭活， 检测管置于室温。后对照管和检测管分别加入 0.4ml试剂A，再分别加人5μl试剂B,混勾后均 置于37℃水浴箱中，避光恒温孵育15min染色。 染色40min内上流式细胞仪，激发波长为488nm， 通过荧光通道FL1（绿）和FL2（红）检测橙红色荧光 强度，每个样本检测5000个精子。

四、统计学分析 采用SPSS23.0软件对数据进行统计学分析。 符合正态分布的计量资料以（π士s）表示，组间比较 采用t检验；采用Spearman分析相关性；采用受试 者工作特征（ROC)曲线法检验，计算曲线下面积 （AUC),以AUC在 0.7～0.9为有一定准确性,以 AUC>0.9为准确性较高,通过敏感度、特异性计算 约登指数（YoudenIndex，YI），以约登指数最大值 (YI Max)对应的检验变量值为截断值。以P< 0.05为差异有统计学意义。